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結核菌特異性分泌蛋白的(de)檢測及其應用

  • 2014-05-09

近年(nián)來結核病疫情呈現上升趨勢,是目前感染率和(hé)死亡率最高(gāo)的(de)傳染性疾病,對結核病的(de)早期診斷及療效觀察的(de)檢測要求越來越高(gāo)。目前實驗室主要依據結核菌的(de)培養,抗酸染色和(hé)PCR方法,對血清中結核抗體的(de)臨床檢測結果褒貶不一(yī)(1)。

 

我們采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清及各種體液中的(de)結核菌特異性分泌蛋白,現報告如(rú)下:
對象與方法
一(yī)、 研究對象:結核病例組:2003年(nián)1月至2005年(nián)6月我院感染科160例結核患者,均為初治患者,男102例,女58例,年(nián)齡13-61歲。診斷標準以《肺結核診斷和(hé)治療指南》為標準。其中肺結核126例,結核性腦膜炎14例,結核性胸膜炎16例,結核性腹膜炎4例。對照組:選擇健康查體中胸透正常、無結核病史的(de)健康人,男女各20例,年(nián)齡24-51歲,平均34歲。
二、 方法
1、試劑 酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血清中特異性分泌蛋白試劑由台灣杏恩科技有限公司提供。
2、標本采集與處理(lǐ):采集所有受試對象(結核病患者在接受抗結核治療前)空腹靜脈血3ml,3000轉/min離心,分離血清,-20℃ 保存。然後采集受試者抗結核治療後24h、48h、96h、7天、14天、30天後空腹靜脈血3ml,離心分離血清,-20℃  保存。
3、測定 ELISA檢測按試劑盒說明書進行。具體過程如(rú)下:(1)取100ul不同濃度的(de)標準品及血清加入反應在孔中,25 ℃ 放置1小時。(2)衝洗3次後,加入酶標記的(de)抗體,25℃ 放置1小時。(3)衝洗3次後,加入TMB顯色液,20分鍾後,在所有孔內都加入100ul終止液,混勻後即用Labsystems酶標儀(芬蘭製造)在450nm處測定各孔溶液的(de)吸光度(A450)值。酶標儀內計算機自(zì)動讀取並顯示標準曲線上與各吸光度相對應的(de)濃度數值,cut off值吸光度為0.42。痰液及胸腹水抗酸染色按《全國臨床檢驗操作規程》第二版進行操作。
結果
一(yī)、 160例結核患者血清結核菌特異性分泌蛋白(A法)與抗酸染色(B法)檢測結果見表1。160例結核患者經ELISA方法檢測血清中結核菌特異性分泌蛋白陽性率為93.1%(149/160),結核患者標本經抗酸染色檢測陽性率為30.6%(49/160),經X2檢驗,二者有顯著性差異(P〈0.01〉。
表1 160例患者血清結核菌特異性分泌蛋白與抗酸染色檢測結果比較
分組
例數
A法檢出率(%)
B法檢出率(%)
結核組
160
93.1(149/160)
30.6(49/160)*
對照組
40
0
0
注:*P〈0.01
二、兩種檢測方法的(de)敏感性和(hé)特異性比較:見表2。
表2  血清結核菌特異性分泌蛋白與抗酸染色法檢測敏感度和(hé)特異性的(de)比較
方法
例數
敏感性(%)
特異性(%)
A
160
30.6*
100
B
160
93.1*
93.9
*P〈0.01
表2顯示,血清結核菌特異性分泌蛋白檢測結核菌的(de)敏感度為93.1%,特異性為93.9%,與抗酸染色法相比有顯著性差異,特異性經統計學分析二者無顯著性差異。
三、抗結核治療後血清中結核菌特異性蛋白會計師的(de)動態變化。觀察49例抗酸染色查到結核菌的(de)患者治療後不同時間點結核菌特異性分泌蛋白含量變化,並同時進行痰液抗酸,結果發現46例患者抗結核治療48小時後結核菌分泌特異性蛋白的(de)會計師開始降低(dī),14天後檢測不到結核菌分泌特異性蛋白。在治療7天後有43例痰標本中仍能查到結核菌,但結核菌的(de)數量明顯減少。另外3例患者治療14天後結核菌分泌特異性蛋白的(de)含量沒有變化,抗酸染色查到結核菌,提示耐藥結核菌的(de)存在。
討論:
抗結核藥物的(de)不合理(lǐ)應用使耐藥菌株不斷出現,緻使結核病的(de)疫性成為感染率和(hé)殘廢率最高(gāo)的(de)傳染性疾病。在結核病的(de)臨床診斷方法中,塗片鏡檢和(hé)培養是經典的(de)細菌學檢測方法,抗酸染色法雖然具有簡便、快速、特異性高(gāo)的(de)優點,但其敏感性差、陽性檢出率低(dī),平均檢出率隻有25%~35%(2),我們應用抗酸染色檢測陽性率為30.6%,與文獻報道(dào)相近。另外抗酸染色法無法區分死菌與活菌,因此其在臨床的(de)應用受到限製。不過抗酸染色法的(de)陽性,檢出結果具有不可(kě)替代的(de)診斷參考價值。細菌培養法由於結核菌生長緩慢,耗時長(常規培養需4~6周),對培養基要求高(gāo)等也影響其陽性檢出率,臨床很少采用培養方法檢測結核菌。我們采用ELISA方法檢測結核菌分泌特異性蛋白,由於該方法檢測活結核菌分泌的(de)特異蛋白,對於初診的(de)未用抗結核藥治療的(de)疑似患者具有很高(gāo)的(de)陽性率和(hé)特異性。通過對160例結核患者結核菌分泌特異性蛋白的(de)檢測,發現其敏感率93.1%,明顯優於抗酸染色法,同時該方法也具有很高(gāo)的(de)特異性(93.9%),因此,我們認為結核菌分泌特異性蛋白的(de)檢測可(kě)以用於臨床對初診結核疑似病人的(de)篩查試驗。
結核菌分泌的(de)特異性蛋白是由活的(de)結核菌所分泌,定量檢測可(kě)以用於抗結核治療的(de)效果觀察,我們的(de)試驗結果發現抗結核治療48小時後結核菌分泌特異性蛋白的(de)含量開始降低(dī),並隨著療程的(de)延長而降低(dī)。同時,定量檢測結果對於耐藥結核菌也有一(yī)定的(de)提示作用,抗結核治療無效的(de)患者,其血清中結核菌特異性蛋白的(de)含量沒有明顯變化。
 我們的(de)試驗結果表明,結核菌分泌特異性蛋白可(kě)以做(zuò)為對初診結核疑似病人的(de)篩查及抗結核治療的(de)療效觀察。由於其隻適用於治療前活結核菌的(de)檢測,對於抗結核薌治療後的(de)患者,結核菌分泌特異性蛋白的(de)診斷作用將會受到一(yī)定的(de)限製。