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結核菌特異性分泌蛋白的(de)檢測及其應用

  • 2014-05-09

近年(nián)來結核病疫情呈現上升趨勢，是目前感染率和(hé)死亡率最高(gāo)的(de)傳染性疾病，對結核病的(de)早期診斷及療效觀察的(de)檢測要求越來越高(gāo)。目前實驗室主要依據結核菌的(de)培養，抗酸染色和(hé)PCR方法，對血清中結核抗體的(de)臨床檢測結果褒貶不一(yī)（1）。

 

我們采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清及各種體液中的(de)結核菌特異性分泌蛋白，現報告如(rú)下：
對象與方法
一(yī)、 研究對象：結核病例組：2003年(nián)1月至2005年(nián)6月我院感染科160例結核患者，均為(wèi)初治患者，男102例，女58例，年(nián)齡13-61歲。診斷标準以《肺結核診斷和(hé)治療指南》為(wèi)标準。其中肺結核126例，結核性腦膜炎14例，結核性胸膜炎16例，結核性腹膜炎4例。對照組：選擇健康查體中胸透正常、無結核病史的(de)健康人，男女各20例，年(nián)齡24-51歲，平均34歲。
二、 方法
1、試劑 酶聯免疫吸附法（ELISA）測定血清中特異性分泌蛋白試劑由台灣杏恩科技有限公司提供。
2、标本采集與處理(lǐ)：采集所有受試對象（結核病患者在接受抗結核治療前）空腹靜脈血3ml，3000轉/min離(lí)心，分離(lí)血清，-20℃ 保存。然後采集受試者抗結核治療後24h、48h、96h、7天、14天、30天後空腹靜脈血3ml，離(lí)心分離(lí)血清，-20℃  保存。
3、測定 ELISA檢測按試劑盒說明書進行。具體過程如(rú)下：（1）取100ul不同濃度的(de)标準品及血清加入反應在孔中，25 ℃ 放置1小時。（2）沖洗3次後，加入酶标記的(de)抗體，25℃ 放置1小時。（3）沖洗3次後，加入TMB顯色液，20分鍾後，在所有孔內(nèi)都加入100ul終止液，混勻後即用Labsystems酶标儀（芬蘭制造）在450nm處測定各孔溶液的(de)吸光度（A450）值。酶标儀內(nèi)計算機自(zì)動讀取并顯示标準曲線上與各吸光度相對應的(de)濃度數值，cut off值吸光度為(wèi)0.42。痰液及胸腹水抗酸染色按《全國臨床檢驗操作規程》第二版進行操作。
結果
一(yī)、 160例結核患者血清結核菌特異性分泌蛋白（A法）與抗酸染色（B法）檢測結果見表1。160例結核患者經ELISA方法檢測血清中結核菌特異性分泌蛋白陽性率為(wèi)93.1%（149/160），結核患者标本經抗酸染色檢測陽性率為(wèi)30.6%（49/160），經X2檢驗，二者有顯著性差異（P〈0.01〉。
表1 160例患者血清結核菌特異性分泌蛋白與抗酸染色檢測結果比較
分組
例數
A法檢出率（%）
B法檢出率（%）
結核組
160
93.1（149/160）
30.6（49/160）*
對照組
40
0
0
注：*P〈0.01
二、兩種檢測方法的(de)敏感性和(hé)特異性比較：見表2。
表2  血清結核菌特異性分泌蛋白與抗酸染色法檢測敏感度和(hé)特異性的(de)比較
方法
例數
敏感性（%）
特異性（%）
A
160
30．6*
100
B
160
93．1*
93．9
*P〈0.01
表2顯示，血清結核菌特異性分泌蛋白檢測結核菌的(de)敏感度為(wèi)93.1%，特異性為(wèi)93.9%，與抗酸染色法相比有顯著性差異，特異性經統計學(xué)分析二者無顯著性差異。
三、抗結核治療後血清中結核菌特異性蛋白會計師的(de)動态變化。觀察49例抗酸染色查到結核菌的(de)患者治療後不同時間點結核菌特異性分泌蛋白含量變化，并同時進行痰液抗酸，結果發現46例患者抗結核治療48小時後結核菌分泌特異性蛋白的(de)會計師開始降低(dī)，14天後檢測不到結核菌分泌特異性蛋白。在治療7天後有43例痰标本中仍能查到結核菌，但結核菌的(de)數量明顯減少。另外3例患者治療14天後結核菌分泌特異性蛋白的(de)含量沒有變化，抗酸染色查到結核菌，提示耐藥結核菌的(de)存在。
讨論：
抗結核藥物的(de)不合理(lǐ)應用使耐藥菌株不斷出現，緻使結核病的(de)疫性成為(wèi)感染率和(hé)殘廢率最高(gāo)的(de)傳染性疾病。在結核病的(de)臨床診斷方法中，塗片鏡檢和(hé)培養是經典的(de)細菌學(xué)檢測方法，抗酸染色法雖然具有簡便、快速、特異性高(gāo)的(de)優點，但其敏感性差、陽性檢出率低(dī)，平均檢出率隻有25%~35%（2），我們應用抗酸染色檢測陽性率為(wèi)30.6%，與文獻報道(dào)相近。另外抗酸染色法無法區分死菌與活菌，因此其在臨床的(de)應用受到限制。不過抗酸染色法的(de)陽性，檢出結果具有不可(kě)替代的(de)診斷參考價值。細菌培養法由于結核菌生長(cháng)緩慢，耗時長(cháng)（常規培養需4~6周），對培養基要求高(gāo)等也影響其陽性檢出率，臨床很少采用培養方法檢測結核菌。我們采用ELISA方法檢測結核菌分泌特異性蛋白，由于該方法檢測活結核菌分泌的(de)特異蛋白，對于初診的(de)未用抗結核藥治療的(de)疑似患者具有很高(gāo)的(de)陽性率和(hé)特異性。通過對160例結核患者結核菌分泌特異性蛋白的(de)檢測，發現其敏感率93.1%，明顯優于抗酸染色法，同時該方法也具有很高(gāo)的(de)特異性（93.9%），因此，我們認為(wèi)結核菌分泌特異性蛋白的(de)檢測可(kě)以用于臨床對初診結核疑似病人的(de)篩查試驗。
結核菌分泌的(de)特異性蛋白是由活的(de)結核菌所分泌，定量檢測可(kě)以用于抗結核治療的(de)效果觀察，我們的(de)試驗結果發現抗結核治療48小時後結核菌分泌特異性蛋白的(de)含量開始降低(dī)，并随着療程的(de)延長(cháng)而降低(dī)。同時，定量檢測結果對于耐藥結核菌也有一(yī)定的(de)提示作用，抗結核治療無效的(de)患者，其血清中結核菌特異性蛋白的(de)含量沒有明顯變化。
 我們的(de)試驗結果表明，結核菌分泌特異性蛋白可(kě)以做(zuò)為(wèi)對初診結核疑似病人的(de)篩查及抗結核治療的(de)療效觀察。由于其隻适用于治療前活結核菌的(de)檢測，對于抗結核芗治療後的(de)患者，結核菌分泌特異性蛋白的(de)診斷作用将會受到一(yī)定的(de)限制。